前 言　　在临床实验室实行方法标准化及质量控制，始于临床化学部门。该部分已有象国际临床化学联合会（IFCC）等国际学术组织在国外推选多年，并已有了一套完整的质量控制体系和成熟的经验。美国的临床化学家协会（AACC），早在1953年就编辑出版了第一部《临床化学标准方法》(standard methods of clinical chemistry)；此后又连续出版多卷。[1]至于临床化学质控的专著亦已出了好多部，大部分已在国内介绍并广泛推行。在临床血液学方面，虽然也有国际血液学标准化委员会（ICSH）和国际血栓与止血委员会（ICTH）等学术组织公布和推行过一些关于血液学检验方法标准化和质量控制的方案，但除了像血红蛋白测定这一类似临床化学的项目卓有成效以外，在其他方面尚不十分成熟，推行也不及临床化学广泛。　　血栓与止血的实验室检查的临床重要性与日俱增，检验内容不断扩大，工作量也日益增多；不断出现的方法革新和自动化，改变了以往单靠手工操作，自配试剂，工作效率低的局面。与些同时，要求方法标准化和实行质量控制的呼声也愈来愈高。然而由于血液学检查，特别是血栓与止血检测的特殊性，迄今为止，除了凝血检验中的凝血酶原时间和活化的部分凝血活酶时间以及最近几年对血浆纤维白原的测定有了标准化的试剂（如PT）、标准品（如纤维蛋白原）、质控品或统一的表达结果的报告方式等以外，其他方面，如血小板的功能测定、抗凝因子及纤溶相关因子的测定等尚未有成熟的方案。　　本文仅就上述已较成熟，并经ICSH、ICTH或美国的国家临床化验室标准委员会（NCCLS）等以文件公布的PT、APTT和纤维蛋白原三项的标准化及质量控制作一介绍。不过，PT（一期法）和APTT是用功能测定（而非免疫学和化学测定）凝血因子的基础，诸多凝血及部分抗凝因子的检测是通过PT或APTT的基本方法来实现的。所以有了这一基础，也便于实现上述各因子测定的标准化和质量控制。　　凝血酶原时间（PT）　　自从1935年 Quick 建立了PT测定方法以来，历经60余年，经久不衰，至今它仍然是检查所谓“外源”凝血途径诸因子及相关抑制物的重要过筛试验，并且是监控口服抗凝药治疗的主要手段。　　PT测定受很多因素影响，诸如标本的采集方法及器材，贮血容器的性质，抗凝剂的种类和用量，标本的运送和贮存条件，孵育温度及时间，凝血活酶试剂的种类和质量（敏感性）以及判读终点的方法等，均会影响测定结果。此外，报告结果的方式也必须统一，特别是用于监控口服抗凝药物治疗时。所有这一切，都必须使方法标准化和建立有效的质量控制。　　早在1973年，在维也纳召开的第四届血栓与止血国际会议上，由ICSH 和ICTH联合成立了口服抗凝药控制专家组（Expert Panel on Oral Anticoagulant Control），要求该组制订推荐一个PT测定标准化方案。经过多个实验室的协作研究，在1975年该专家组提出了第一个人血一期凝血酶原时间试验参考方法(reference method for the one-stage prothrombin time test on human blood)并于1976年发表（编号ICSH-EP14/1：1975）。[2]该文件重点是讲标本采集和PT的测定方法，对于报告结果和质量控制只简单地提了几句。而至关重要的PT试剂--凝血活酶的标准化问题，当时虽已注意到，但因条件尚未成熟，仅答应进一步研究完成后再修订。众所周知，不同的凝血活酶，检测相关的凝血因子缺乏的敏感性是不同的。因此要使PT标准化，使不同的实验室虽用了不同的凝血活酶，也能得到同样的（可比的）结果。　　此后，经过几个著名实验室历时数年的共同努力，并用世界卫生组织（WHO）参与，以当时已在英国作为统一标准使用的“英国比较凝血活酶”(british comparative thromboplastin,简称BCT)为基础，制备了WHO的原级凝血活酶参考品(primary reference preparaation)人脑制品，编号67/40；同时制备了牛脑（68/34）和免脑（70/178）两个月67/40标化的次参考品(secondary reference preparation)。[3~4]后来，WHO又发表了其他一些次级参考品，迄今已在世界各国广泛用于校正本地制备或工在生产的PT参考物。[5]

　　2、可接受的变异性（acceptable variability）　　对于同一批质控血浆，分析系统中的试剂、仪器、加（取）样装置以及定时器等总的天与天之间的变异系数（不精密度）CV不得超过5%。　　3、重复实验的变异系数（coefficient of variation for replicate test）　　同份标本测定两次（下称双份测定），其差值的大小，可用来评价分析系统的批内精密度。正常血浆及异常（比正常延长1-2倍）血浆的双份测定，其CV 不应超过5%。　　4、双份测定重现性（reproducibility of duplicate）双份测定之间的差值的大小，通常用来作为结果可接受性的标准。此点有助于核查系统不精密度和/或偶然的分析误差。虽然这种由操作构成的差值的大小会因所用分析系统不同而有所变化，一般用双份测定之间的两次测定平均差10%作为可接受的标准。5、室内质评：各实验室必需积极参加由检验中心组织的室间质评活动，以便及时了解本单位PT测定的准确性。虽然因仪器和试剂不同，同一份质控血浆可得到不同的结果，但用手工法，同一试剂结果是一致的。此外，不同类型的仪器/试剂，如分开统计，也有一定可比性。故回报时，应将仪器型号和试剂厂牌及批号等附上，以供比较。　　九、造成结果错误的各种原因　　1、样器(Specimen)或标本（Sample）有关的问题　　⑴血样收集管注入血液过多或不足。　　⑵患者红细胞比积>0.55%时未校正枸橼酸盐液体积.　　⑶用了不
正确的
抗凝剂(如EDTA或草酸盐)或未加抗凝剂,或浓度不准确.　　⑷用了已凝固、溶血、黄疸或脂血样品　　⑸血样混匀不当或太剧烈的混匀。　　⑹采血品或贮血管不洁，已受到污染。　　⑺污染了肝素。　　2、分析前的错误　　血样送验延误或用了不合规定的方法运送、处理或贮存血样。　　3、与试剂有关的问题　　⑴试剂已被污染　　⑵复溶时稀释剂加量不准确.　　⑶复溶时未用推荐的试剂。　　⑷试剂在运输、贮存过程中，由于处理不当而变质。　　⑸试剂复溶后超过了规定的稳定期或试剂已超过有效期。　　4、分析过程的错误　　如孵育时间不准确：温度、加试剂量以及仪器操作布骤不准确等。　　最后是安全性问题：由于接触血液有可能导致HIV、HBV或HCV的感染。国外对实验室工作人员的安全防护极为重视，在其操作规程中都将安全防护列为重要项目，PT和APTT的测定也不例外。在采集、运送及处理血样时，随时都要防止血样污染人体。操作中尽可能要戴手套。用一次性采、贮血样器具，用完后按规定消毒处理等。　　　　　　　　　　　　活化的部分凝血活酶时间（APTT）　APTT是检测内源途径凝血因子缺陷和相关抑制物（包括狼疮抗凝因子）的试验，也是当前用于凝血因子治疗及肝素抗凝治疗监控的主要手段；其临床应用频率仅次于PT或与之相当。APTT是从复钙时间和部分凝血活酶时间（PTT）改良而来。它用磷脂作为血小板代替物，加到去血小板血浆中，同时加入了活化第VII因子的激活剂。较之PTT，其凝固时间缩短，并且排除了血小板数量和功能对血浆凝固的影响。　　和PT测定一样，不同的部分凝血活酶试剂对肝素和各种凝血因子缺陷的敏感性相差很大；不同的激活剂及激活时间对测定结果也很大影响。迄今为止，ICSH和ICTH尚未有APTT测定标准化或试剂标准化的方案，仅NCCLS于1992提出了一个编号为H29-T的暂行方案。[11]　　1994年Reed等组织了13个实验室（中心）协作，试图将PT测定用的ISI和INR 体系用于标化APTT试剂，以便用肝素治疗的临控，结果大失所望。[13]他们用在体外加入不同量肝素的冻干血浆（体外肝素血浆）、新鲜血浆和接受肝素抗凝冶疗，血浆中含有肝素的血浆（体内肝素血浆），按PT标化凝血活酶试剂的方法进行测定，结果发现，各种部分凝血活酶试剂，其体外肝素血浆和体内肝素血浆的敏感性有很大差别。他们用了五个试剂，也用ISI来统一标化，结果不成功。因为无论用哪一个试剂作标准，实验室之间差别都很大。正常及病人血浆凝固时间的回归线往往不平行或偏斜。因此认为用这种方法标化部分凝血活酶不理想。而1995年Vander velde 和 poller由 ISTH/ICSH组织协作研究用APTT监测肝素的标准化，[13]所得结果有所不同（所有的方法基本相似），他们选用的三个试剂中，有两个几乎同样地好，其中一个被选作参考试剂。但他们也不主张用单一标上b值（校正常数，即病人和正常血浆回归线的斜率）的试剂，供所有实验室使用，而要各实验室自己标定自己的试剂。总之，APTT试剂和测定的标准化还远未成熟。以下就NCCLS推荐的方法，结合其它资料作一介绍，供国内APTT测定标准化参考。

　　　　　　　　　　　　纤维蛋白原测定　　纤维蛋白原是所有凝血因子中含量最高的一种凝血蛋白，其在血浆中的浓度可高达4g/L；其分子结构以及由纤维蛋白原转化为纤维蛋白的详细化过程（包括纤维蛋白（原）经纤溶酶溶解生成FDP的过程）早已搞清。就是这样一种蛋白，至今仍无理想的临床常规检测方法。文献中查到和临床实验室正式使用过的检测方法有数十种。这些方法有的精密度及准确性较好，但操作过于复杂、繁琐，不适于常规应用；有的虽简便、快速，但准确性及精密度都较差。现有的方法大体上分三大类：即（1）基于凝血酶的作用，形成纤维蛋白的方法；（2）物理化学测定法和（3）免疫学测定法。　　第一类方法是一种功能测定法，所形成的纤维蛋白，又可再分为测重法，酚试剂比色法和紫外光度法、测氮法、浊度法和凝血酶凝固时间法等。这类方法的优点是测定的是有凝血功能的纤维蛋白原，又称为可凝固蛋白（clottable protein），故特异性较好。方法可简可繁，常规使用中，多采用较简便的Von Clauss法。[17]根据这种方法设计的商品药盒（kit），已在一些国家广泛使用。据1975年美国CAP的调查，1939个临床化验室中，用此法者占1824家，即94%用了本法，其中Tan等采用了速率法。[16]这类方法中由Ratnoff 和 Menzzie改良的酚试剂比色法，其曾被提出作为参考方法。近几年来，不少文献推荐用Jocobsson的改良法作为纤维蛋白原标准的定值方法。这类方法的缺点是，从理论上讲，有两方面可引起误差。一是所析出并测定的是纤维蛋白而非纤维蛋白原。已知纤维蛋白原变成纤维蛋白时会从α和β肽链上分别切下两个短肽，即A肽（FpA）和B肽(FpB)。这样纤维蛋白实际上比纤维蛋白原的质量少了10%。[14]二是已知纤维蛋白旦形成，就会吸附一些凝血因子或纤溶因子，这样又会增加所测纤维蛋白原的量。此外，本法在操作中在获取纤维蛋白和洗涤（挤压）除去其它蛋白成份时，不仅比较麻烦而且也难以完全彻底，会造成其它蛋白污染。　　第二类方法（物理化学测定法）在我国应用最广。这类方法又可分为盐析法（包括用亚硫酸钠、硫酸铵或氯化钠盐析，用蛋白质显色或比浊法测定），热变性沉淀法和电泳法等几种。这类方法都比较简单、快速，尤其适于急诊检验，但缺点是本法的特异性不强。所测的不是有凝固功能的纤维蛋白原，可能包括部分的降解产物和/或其它蛋白。而电泳法又太繁琐，不适于常规工作。　　第三类方法（免疫学方法），是将纯纤维蛋白原作为抗原免疫动物，制成多克隆或单克隆抗体。然后用免疫胶乳、被动血凝或反向血凝、单向免疫扩散、火箭电泳以及ELISA等方法测定。优点是大部分方法简便，但缺点是所测的不仅是可凝固的纤维蛋白原，可能包括了它的降解产物（因为它们有共同抗原），也可能包括了障碍性纤维蛋白原（dysfibrinogens即N端谷氨酸γ位未羧化的无功能的纤维蛋白原,又称缺维生素K引起的蛋白质，PIVKA）。但免疫法也有一个好处，就是可用来测定PIVKA。如果一个患者总纤维蛋白原（用免疫学测定结果）不低，甚至增高，而功能性（即可凝固性）纤维蛋白原却明显减少，即可判断为存在PIVKA。肝病、维生素K缺乏等均可导致PIVKA升高，有临床诊断价值。总的说来，免疫学方法用于临床常规实验室仍存在一定问题。　　近年来，国内引进很多自动血凝分析仪，这些仪器在测PT时往往同时报告纤维蛋白原。其原理和理论根据是：当PT测定完成时，全部纤维蛋白原均变成纤维蛋白（相当于Clauss法血浆中加入了凝血酶），其形成的浊度与纤维蛋白的含量成正比。因此，不需另加任何试剂，即可由浊度直接推算出纤维蛋白原的含量。故本法又称为PT导出（或衍生）纤维蛋白原测定法，简称PT-Der法。关于本法的可靠性，国外不少研究者已作过比较，总的情况是：此法精密度相当高，当血浆纤维蛋白原含量在正常范围时，PT-Der法与经典的Clauss法无显著差异或略高于Clauss法；但当纤维蛋白原减低时，PT-Der法往往偏高（p<0.001）,故此法用于纤维蛋白原含量减低者应慎重.国内目前采用此法者已逾来逾多。由于不断有文献报道，血浆纤维蛋白原水平的变化不仅与凝血障碍、出血、DIC、应激（因为它也是一种急性期蛋白）有关，而且与冠心病，心肌梗塞有关，因此临床上倍受重视。不仅工作量增大而且对方法准确性的要求也越来越高。但至今WHO、ICSH和NCCLS仍未明确提出一个纤维蛋白原的标准化或推荐方法，供临床常规使用。但作为方法标准化的第一步，纤维蛋白的标准已经有国际参考制品；另外用于标准品的标化也有一个推荐方法。以下重点介绍这两个方面。

　　一、纤维蛋白原的国际标准品　　1992年英国国家生物标准及控制研究所（NIBSC），研究完成了一个纤维蛋白原标准品，编号为89/644，向WHO和生物标准专家委员会（ECBS）推荐，[15]并被ECBC批准为国际参考品（IRP）。从此，各国均引进这一标准品来标化本国或工厂生产的次级标准品（我国卫生部临床检验中心亦已在引进）。使纤维蛋白原测定的标准化工作，走出了关键的一步。因此根据以往的调查。各家标准品纤维蛋白含量互相差别很大，有的竟相差达到200%！　　二、推荐的测定方法　　各家用IRP来标化自己的标准时，推荐采用Jacobsson的改良法，现将该法介绍如下。　　试剂　　1、缓冲液：Na22H2O 0.882g; KH2PO4 2.77g加水至1L，此为贮存液；将贮存缓冲液1份，加生理盐水2份即为应用缓冲液，PH为6.35。　　2、生理盐水：0.15mo1/L　　3、人或牛凝血酶，500IU/ml,生理盐水溶液。　　4、凝块溶解剂：尿素400g溶于少量蒸馏水中，继加入200ml 1.0mol/L NaOH,再加水至1L。　　操 作：　　将纤维蛋白原冻干（标准）品（源于89/644）加1ml蒸馏水复溶，加到含有2ml应用缓冲液的有机玻璃浅盘或其它容器中，再加入凝血酶液50ml,迅速混匀，在室温中静置2小时。将容器倒扣于吸水的布上（其下可垫吸水纸），再用适当物质（如滤纸）将凝块吸干。将凝块取下，置于50ml生理盐水中洗涤两次，每次洗涤后均应将凝块吸干（可用玻璃挤压凝块），尽量除去含于凝块中的液体，以免液体中的其它血浆蛋白残留。必要时可在清洁棉布上挤压。　　小心将凝块加入含凝块溶解剂7.5ml的容器中，摇匀，直至凝块完全溶解后混匀。倒入光径为1cm的比色杯中，以凝块溶解剂为空白，在280nm和 315nm波长读取吸光度（A）。　　计 算：　　纤维蛋白原浓度（g/L）=（A280-A315）×7.5/15.87=(A280-A315)×0.47　　式中15.87为纤维蛋白在碱性条件下波长280nm的消光系数;7.5为 纤维蛋白原的稀释倍数。　　当A在1.0以下时，吸光度与浓度呈线性关系。如A大于1.0，应稀释标本重新测定，重新乘稀释倍数。　　上述方法，比较繁琐，仅适用于参考液的标定。至于常规工作中的纤维蛋白原测定，比较简便、准确、精密度也较好的是凝血酶凝固时间法，即Clauss法，现介绍如下。　　三、适于常规工作的纤维蛋白原测定方法（Clauss法）　　原 理：　　将凝血酶加到血浆中，使纤维蛋白原变成纤维蛋白，使出现凝固。在有足量的凝血酶时，与不同含量的纤维蛋白原作用，其出现凝固的时间与纤维蛋白原含量呈负相关。　　试 剂：　　1、牛凝血酶100NH/ml　　2、纤维蛋白原标准品（IRP次级标准）　　3、缓冲液（下列两种任选一种）：　　（1）巴比妥缓冲液（PH7.5）；巴比妥钠2.75g,璐氯化钠7.3g溶于750ml去离子水中,校正至PH7.5,加水至1L。　　（2）咪唑（Imidazole, 或 Glyoxaline）缓冲液：咪唑3.4g(0.05M),氯化钠5.85g，加于约500ml水中；加0.1mol/L盐酸186ml,调pH至7.3-7.4，最后加蒸馏水至1L。　　测定步骤　　1、手工法　　（1）用上述缓冲液先将标准品稀释成0.8,1.6,2.4,和4.0g/L纤维蛋白原浓度。各浓度再用缓冲液作1：10稀释。　　（2）患者血浆及质控物用缓冲液作1：10稀释。　　（3）浆含100NHU/ml,混匀后室温保存。　　　如用仪器法测定，则用100NIHU/ml,不必稀释。　　（4）在一试管中，加稀释血浆0.2ml,置37℃水浴中4分钟。　　（5）加入预温37℃的凝血酶液0.2ml,摇匀并立即开动秒表,不断观察凝固时间。至出现凝固时停表。　　（6）每份标本测定两次，求平均数。同时测定各标准管和对照（质控）管，方法相同，准确记录时间。　　（7）计算　　用双对数计算纸作图，以凝固时间为纵坐标，纤维蛋白原浓度为横坐标，将各相应浓度的标准管对凝固时间，在图上标出相应的点并连成直线，制成标准曲线。然后根据患者和质控血浆所得的凝固时间，在图上查到纤维蛋白含量。　　如血浆纤维蛋白含量大于4g/L，应稀释血浆后重测，结果乘以稀释倍数。　　如血浆纤维蛋白含量低于0.8g/L，需浆原血浆改为1：2或1：5稀释，在标准曲线上查得结果后除以5或除以2。　　2、仪器法　　本法可用自动或自动凝血仪，按凝血酶时间（TT）测定法测定。可自动打印出结果。一般仪器法比手工法精密度高，尤其是在含量高时，仪器法比手工法更好。　　本法的干扰因素主要是肝素。在高浓度时可造成假的低值（可通过加入硫酸鱼精蛋白而消除）：PIVKA变可造成假低值。　　　主要是误差来源　　1、血浆稀释不准确　　2、凝血酶活性不足或丢失。凝血酶一般应在低温保存，稀释后在塑料（聚乙烯）试管中4℃保存,可保存活性24小时.　　3、测定终点观察不准确，尤其是纤维蛋白原含量高时，往往在8秒钟左右即凝固，手工法重复性较差，不易做准。