仅为个人的一点思考，欢迎大家共同讨论、指正。
剪膜虽然能加快实验速度，但是却不够严谨，有的人只转部分胶，有的人剪膜（我之前也这么干，确实爽），最后图像都只是单一条带，marker没了，如何证明这就是目的蛋白呢？或者拼接显像后也存在明显的剪切痕迹，如何排除高技术的人为故意拼接呢？失去了半定量wb的同批次严谨性。有人说条带形状一样可以证明吗？显然不足以。一张膜的上下部分条带形状会不一样的。wb为造假重灾区，个人相信会有越来越多的杂志要求全膜，尤其是高质量的杂志，看近1年发帖，sci rep都要求全膜了诶。即使现在尚未普及，志存高远，不希望留下把柄的科研人们在实验条件允许的情况下是否应考虑尽量减少裁剪呢？试想文章发表后杂志要求raw data中未裁剪的wb，难道要再补实验吗？后怕…………一时裁膜一时爽……会一直爽吗？
ECL发光方法中全膜显多蛋白有难度，虽然荧光二抗中不同种属、不同波长颜色的组合搭配可以解决很多难题，但对仪器有要求，成本也高一些。如何用普通HRP二抗+ECL实现全膜两种蛋白或跟多呢？个人理论思考，需要根据实际情况验证。
1.两种一抗同时孵育：最理想的情况：一抗间没有交叉反应性，非特异性条带不会相互重叠，摸索好各自的稀释倍数，孵育时间相同。交叉反应性我理解的意思是两种抗体间起作用了，和各自的目的蛋白结合情况就变了，比如结合少了，或者结合了其他非特异性条带（更常见吧……）。单抗间应该会小于多抗间，有人说同种属的交叉反应性要比不同种属间小，有人则认为相反，具体如何呢？另外也可以购买经过交叉吸附的抗体，价格要贵。可以尝试孵育袋中几百微升小膜做做看，毕竟真的省时间。
①一抗同种属：一种二抗+显影：前提是二抗稀释倍数和时间相同。但如果信号强度差别大，曝光时可能会有干扰。
②一抗不同种属：混合二抗显影：又可能存在二抗交叉反应性等问题；顺序发光显影（更好？）：如先孵育羊抗兔显影后，tbst洗掉残余ECL（不需要很长时间），再孵育羊抗鼠二抗显影，理论可行，但第一次残存的二抗是否会和第二次二抗交叉反应，或造成高背景呢？加二抗前封闭2h会不会更好？
即：二抗1+显影+tbst洗掉ECL+奶粉封闭2h+tbst洗+二抗2+显影
2.一抗分开孵育：
①蛋白1显影后，再加蛋白2一抗。A 一抗同种属：不少人建议strip，原因：第一次残留二抗会和第二次一抗结合，放大信号？我不这么认为。高背景可以尝试增加奶粉封闭把……B 不同种属：也不能排除交叉反应，但应该不影响。
即：蛋白1一抗二抗显影完毕+tbst洗掉ECL+奶粉封闭2h+tbst洗+蛋白2一抗二抗显影
另外如果你掌握好strip的度，中间strip一次是最理想的程序。
②两种一抗连续孵育：如果第二种一抗也是长时间过夜孵育，可能减弱第一种一抗的结合吧。内参一抗室温数小时的话可以尝试，但也难以避免交叉反应（此内参一抗不能再用于搭配其他蛋白了）。 余同1①②，同种属应该更好吧。
另外也有人认为，如果两种蛋白相差分子量过大，转到同一张膜一起显色也是不科学的。
2种目的蛋白，一抗同源，先共孵育试试，再考虑2①+奶粉封闭（第二种一抗不再搭配其他蛋白）；一抗不同源不加奶粉封闭。
目的+内参，一抗同源，尝试连续孵育后同时显影，再考虑2①奶粉封闭；不同源2①不用奶粉封闭了。

过来看看哈