在扩增反应的线性部分期间进行PCR产物的测量，从而允许模板的准确定量。几种用于PCR产物的实时定量的方法，包括使用荧光标记的引物或分子信标的荧光共振能量转移技术。还可以使用Cyber Green 监测反应期间PCR产物的鉴定。此外，通过在线毛细管PCR结合激光诱导荧光检测，向反应混合物中添加Cyber Green 染色，检测出单个DNA分子.Cyber Green 优先结合dsDNA，可以准确定量双链产物。单链寡核苷酸引物的存在。 Cyber Green 在PCR反应所需的极端温度下具有高稳定性，不会干扰Taq聚合酶。通过在测定后使用Cyber Green 测量产物的熔融温度，可以实现定量所需产物的改进的特异性。没有碱基错配的双链DNA将显示比含有错配的非特异性模板更高的解链温度。实时定量PCR实验可以通过使用专用于该应用的仪器或通过在不同时间点手动量化扩增产物来进行。
使用Cyber Green 的实时定量PCR用于基因突变的可靠且简单的测定，包括蚊子抗药性基因的重复和缺失，人类疾病基因中的染色体易位和碱基替换。它还被用于鉴定病毒，细菌或真菌病原体。此外，该方法已成功用于定量逆转录PCR。
图1.使用Cyber Green对KIR基因（杀伤细胞免疫球蛋白样受体）的10倍系列稀释液（3×10 5至3个copies）进行实时定量PCR的扩增曲线。