分子生物 - 技术
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世外客_赢 楼主
  分子生物学技术作为现代生物技术中最为先进的实验手段之一,已经广泛渗透到生命科学的各个领域,对于基础医学和临床医学研究起到了重要作用。
2013年06月30日 18点06分 1
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世外客_赢 楼主
克隆表达
分子生物学中最基本的技术是蛋白质的表达和纯化。首先是编码目的蛋白的DNA序列被克隆(用PCR技术和限制性内切酶)到作为表达载体的质粒中。随后构建好的质粒被引入到宿主细胞。编码序列在质粒上的特殊的启动子元件的驱动下,被宿主细胞的表达系统所表达。质粒上通常还带有抗生素抗性标签以便于质粒筛选。
  质粒可以被插入到细菌或动物细胞。外源DNA被引入细菌被称为转化,可以通过电穿孔法、微注射法、正吸收和融合来实现;外源DNA被引入真核细胞,如动物细胞,被称为转染,转染技术包括磷酸钙法、脂质体法和一些有专利权的商用转染试剂。DNA也可以以病毒或病原菌为载体被带入宿主细胞;应用这种病毒或病菌的转染技术于细胞时,用术语来说就是“对细胞进行转导”。
2013年06月30日 18点06分 2
表达克隆,英文名称:expression cloning;定义:通过进行基因表达而克隆目的基因的方法。用表达载体构建互补DNA(cDNA)或基因组DNA表达文库,转入细菌或细胞内进行表达,再通过特定表型进行筛选,从而获得目的基因克隆。该方法可以对任何能表达可筛选表型的基因进行克隆。
2013年06月30日 19点06分
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世外客_赢 楼主

多聚酶链式反应
  多聚酶链式反应是一项用于体外复制DNA的极为通用的技术。简而言之,PCR技术可以使单链DNA被复制数百万次,也允许用事先确定好的方式对被复制的DNA序列进行改动。例如,PCR技术可以用于引入限制性酶切位点,或者对特定的DNA碱基进行突变(改变)。PCR技术还可以用于从cDNA文库获得特定的DNA片断,或者从另一个角度,用于判断一个cDNA文库中是否含有特定的DNA片断。
  多聚酶链式反应(PCR):一种体外扩增DNA的方法。PCR使用一种耐热的多聚酶,以及两个含有20个碱基的单链引物。经过高温变性将模板DNA分离成两条链,低温退火使得引物和一条模板单链结合,然后是中温延伸,反应液的游离核苷酸紧接着引物从5‘端到3’端合成一条互补的新链。而新合成的DNA又可以继续进行上述循环,因此DNA的数目不断倍增。
    
  多聚酶链式反应 - 合成
  
2013年06月30日 18点06分 3
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世外客_赢 楼主

凝胶电泳
  凝胶电泳是分子生物学最主要的一项技术。其基本原理是:DNA、RNA和蛋白质可以用电场来进行分离。在琼脂糖凝胶电泳中,DNA和RNA可以被琼脂糖凝胶按其分子大小进行分离。同样,蛋白质可以被SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按分子量大小分离;此外,蛋白质还可以由于所带电荷的不同被等电聚焦电泳分离。
  凝胶电泳(英语:Gel electrophoresis)或称胶体电泳 是一大类技术,被科学工作者用于分离不同物理性质(如大小、形状、等电点等)的分子。凝胶电泳通常用于分析用途,但也可以作为制备技术,在采用某些方法(如质谱(MS)、聚合酶链式反应(PCR)、克隆技术、DNA测序或者免疫印迹)检测之前部分提纯分子。
2013年06月30日 19点06分 4
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世外客_赢 楼主

墨点法
南方墨点法
  分子生物此方法的命名源自其发明者生物学家Edwin Southern。南方墨点法(墨点或称印迹)是探测一个DNA样品中含有特定DNA序列的方法。首先,DNA样品为凝胶电泳所分离;然后,分离的样品通过毛细现象被转移到一张膜上,这一过程被称为“印迹”。带有样品的膜就可以用与目标序列互补的标记的DNA标记探针来探测。最初的操作手册大都采用放射性标记,但现在非放射性标记已开始被采用。自从PCR技术被用于检测特定DNA序列后,Southern印迹法在实验室中的应用大为减少。但此方法依然有着其他一些应用,如用于测量转基因鼠的转基因拷贝数,以及用于构建基因敲除的胚胎干细胞系。
  
北方墨点法
  北方墨点法被用于研究特定类别的RNA分子的表达模式(丰度和大小)。与南方墨点法相似,RNA样品为凝胶电泳按大小分离;然后转移到膜上,并用与目标序列互补的标记的探针来探测。实验结果可以根据所用探针的不同以多种方式来观察,但大多数都显示的是样品中被探测的RNA条带的相对位置,也就是分子大小;而条带的强度则与样品中目标RNA的含量相关。这一方法可以测量目标RNA在不同样品中的情况,因此已经被普遍用于研究特定基因在生物体中表达的时刻和表达量,也是这类研究中最基本的手段。
  
西方墨点法
  大多数蛋白的抗体可以通过将少量的蛋白注入动物(如鼠、兔、羊)以获得对应注入蛋白的抗体(多克隆抗体)或进一步通过细胞培养获得抗体(单克隆抗体)。这些抗体就可为许多分析和制备技术所使用。在西方墨点法中,蛋白质首先根据分子大小用SDS-PAGE分离。然后将胶中的蛋白质转移到膜(如PDVF膜、尼龙膜或其他可用的膜)上。然后将膜用含有抗体的溶液浸泡,由于抗体可以特异性地结合到目标蛋白上,因此就可以探测膜中的目标蛋白。同样观察结果的方法有很多,包括显色产物、化学发光或放射自显影。一些与西方墨点法相似的方法可以用于直接对细胞和组织中的特定蛋白进行染色,然而这些被称为“免疫染色”的方法更多的是应用于细胞生物学而非分子生物学。
  此外,还有并不常用的“东方墨点法”(对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析)、“西南方墨点法”(研究蛋白质和DNA相互作用)和“远端西方墨点法”(Far Western blotting,研究蛋白质-蛋白质相互作用)。值得一提的是除了南方墨点法的命名是来自于发明者的姓名,其他墨点法的命名则都是源于发明者的幽默:因为南方既是墨点法的发明者Edwin Southern的姓,同时其英文含义为“南方”;于是随后发明不同印迹法的研究者们纷纷将这些方法以方位命名,如Northern(“北方”),Western(“西方”)印等等。
2013年06月30日 19点06分 5
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世外客_赢 楼主
  
微阵列技术
  微阵列也可以用除了DNA以外的分子来制作。如抗体微阵列可被用于检测血液样品中含有哪些蛋白质或细菌。
2013年06月30日 19点06分 6
微阵列技术microarray technology; 定义:一种研究有多少基因能相互作用以及一个细胞网如何同时控制大量基因的新方法。这种方法利用机械手精确地将大量DNA分别点到载玻片上。研究者然后从他们研究的细胞中提取的DNA标上荧光标记。
2013年06月30日 19点06分
标记探针能与载玻片上的DNA互补连接。将载玻片放入扫描仪下,测量每个荧光点的亮度,亮度反映了特定DNA片段存在的量。
2013年06月30日 19点06分
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世外客_赢 楼主
  
过时的技术
  随着新技术和新方法的不断出现,旧的技术很快就被抛弃。一个很典型的例子就是DNA分子大小的测量:在(琼脂糖/聚丙烯酰胺)凝胶电泳出现之前,DNA分子大小是用蔗糖密度梯度沉降法来测量的,这一方法费时费力而且花费昂贵;而在梯度沉降法出现之前,使用的是黏度法。尽管已经不再为人们所关注,但了解这些过时的技术可能会对解决一些特别的问题有帮助
2013年06月30日 19点06分 7
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