生化体 生化体
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生化体的吧 结果与讨论 3.1 。 HS-SPME法的优化 是首选的第一无效尿液样本,因为它们展示 一些生活方式的因素相比,影响较小 点尿样品。这些生活方式的因素可以作为 混杂因素在代谢组学分析[ 38 ] 。如 有机挥发物呈现出宽的浓度范围 和物理化学特性,效率 提取的依赖于该方法 用[39] 。在这项工作中,我们评估的影响 pH值,纤维涂层等因素的影响,加入盐,提取 温度(文本) ,提取时间(文字)和孵化 时间( TINC )影响的HS-SPME和 确定了最佳条件,其中包括那些研究, 基于总反应区的意思是和再现性 (CV%)各组条件下获得的。该 色谱图进行降噪和 表2 因素,水平和条件的实验领域应用 顶空固相微萃取( HSSPME )优化了提取。 变量变量编码 ? AA ? 1 0 1 + AA 氯化钠(G ) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 孵育时间( TINC ,分钟) 0 5 10 15 20 提取时间(文字,分钟) 15 30 45 60 75 提取温度(T , ℃) 30 40 50 60 70 A A = 2.000 。 4 M.蒙特罗等人。 /欧洲癌症杂志XXX的(2014 ) XXX-XXX 请引用本文按为:蒙泰罗M.等,挥发性人通过固相微萃取结合尿代谢组分析用气相色谱 - 质谱生物标志物的发现:在应用试点研究与肾细胞癌,欧元J癌症( 2014年) ,包含http://歧视患者 dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2014.04.011 只有比强度的三倍更高的山峰 信号与噪声的比值,记录峰值的整合。 三个pH值(酸性,生理和基本)和 五种类型的固相微萃取纤维( 50/30流明二乙烯基苯/ carboxen /聚二甲基硅氧烷( DVB / CAR / PDMS) 65流明二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷( DVB / PDMS ) , 100流明聚二甲基硅氧烷( PDMS ) , 7流明 PDMS和85流明聚丙烯酸酯( PA) )进行了研究, 优化了提取条件。此外,一个 响应面实验设计成立 调查的其他四个因素的影响;加入盐, 提取温度(文本) ,提取时间(文字)和 孵育时间( TINC ) ,以达到最佳的 分析性能。 3.1.1 。 pH值的选择 它是众所周知的,尿呈现出高度的个体 和个体内变异性[ 40〜43] ,这 可能会影响负面结果的解释 引入额外的偏置。此外,样品的pH值 极大地干扰了基本的电离状态 与酸性化合物和HSSPME的效率 提取是由它的存在增强了他们的 中性形式[ 44 ] 。因此,样品的pH值是非常重要的 参数优化时予以考虑。 一个HS-SPME过程。图。图1示出的结果 所测试的各pH值获得的平均总面积 对于自己的能力来提取挥发性代谢组学 简介人体尿液中。的提取条件 是相同的相对于所述均衡和 提取时间,温度,顶空体积和 量的试样,并在所获得的区域的差异 是仅依赖于样品的pH值。基于 这些结果,作为酸性pH值( pH值= 2)是一个与 较高的平均总面积响应值,其被选择 作为最佳提取pH值对代谢组学 分析尿液样本。事实上,仅仅基于所述 总面积响应值,有人认为这 是代表更高的金额化合物 提取。此外,根据峰值复杂 色谱图如图所示。 2 ,在酸性pH值 似乎有收集挥发最佳容量 人尿样品中的内容。然而,它会 是重要的,有条件的,就是在酸性pH值的提取 酸性化合物主要是看好了 基本的,这并不意味着酸性代谢 作为癌症生物标志物更重要。 一些化合物在尿中作为偶联物消除, 其中,由于其较高的分子量,并 在一般情况下,较高的亲水性[45],往往不太 波动。因此,使用在酸性pH值可提高 这种化合物在其非共轭量 形式和额外的挥发性化合物的释放 从而获得更高的总响应区域。事实上, 了类似的结论,从最近的一项研究得出 其中天然人尿样和人尿 通过酶解处理,以进行分析 向这些样品中的加臭剂的特征。在 处理过的尿液样本有被确定气味更 当比较化合物(总共35化合物) 与未经处理的样品(仅20个化合物) [ 46 ] 。我们的 结果与那些罗恰达成协议 等。 (2012)示出了使用酸性pH值的 ( pH值2.0 )允许一个更好的HS-SPME萃取 人尿样品,无论是在化合物的总量而言 总的GC ?气相色谱峰 区域,相对于生理pH (5.8)和较高 pH值(12.0) [29]。然而,强酸性条件下 也可能引入一些错误,因为一些非共轭 和pH敏感的化合物可进行化学 降解。然而,由于健康和癌症样品 也同样处理,任何化学退化 可能会出现由于酸性pH值会在这两个被认为是 类型的样品。 3.1.2 。光纤涂料的选择 固相微萃取纤维的选择是正确的特别 的重要性,尤其是在不相关的代谢组学实验 其目的是要覆盖最大可能的 量的代谢产物(具有不同浓度 范围和理化性质),在这种情况下, 各样品的挥发性代谢。 对于该测定, 5纤维(DVB / CAR / PDMS ,DVB / PDMS , PDMS 100流明, PDMS 7 LM和PA )分别为 测试它们的提取效率。的整体性能 根据总的各纤维,评价 平均峰面积的和可再现性。图。图3示出了 结果每个固相微萃取纤维获得的总平均面积 对于自己的能力,提取挥发测试 部分汇集人尿。由于每根纤维 在相同条件下暴露于顶部空间 图。三个层次的pH值对提取的效率1 。影响 汇集来自人尿挥发性化合物采用顶空固 固相微萃取( HS-SPME ) 。结果呈现为平均值 获得的气相色谱 - 总响应区域的一式三份的值 离子阱/质谱法( GC-IT/MS )色谱图 和标准偏差。 M.蒙特罗等人。 /欧洲癌症杂志XXX的(2014 ) XXX-XXX 5 请引用本文按为:蒙泰罗M.等,挥发性人通过固相微萃取结合尿代谢组分析用气相色谱 - 质谱生物标志物的发现:在应用试点研究与肾细胞癌,欧元J癌症( 2014年) ,包含http://歧视患者 dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2014.04.011 的平衡时间,萃取时间和温度, 在所获得的区域中的差异显示提取 在分析中使用的纤维涂层的效率。该 纤维这表明了最高的性能 尿中挥发性代谢产物为DVB / PDMS 。此外, 这种纤维具有较好的重现性比较 符合DVB / CAR / PDMS纤维(另一纤维 混合极性)。对于所有光纤类型的变异系数 ( CV % )为低,用于DVB / PDMS分别为2.16 % , 用于DVB / CAR / PDMS 12.09 % ,为100流明8.90 % PDMS , 5.37%为PA和7流明的PDMS 1.00 % 。 3.1.3 。实验条件的优化 几种因素可以提高提取效率 通过促进挥发物从液体转移 (尿),以气相(顶部空间) 。在那些之中, 我们选择的含盐量,提取时间, 孵化温度和提取测试时间 和优化方法。使用的实验水平 每个因素都按照既定的 文献资料[ 28,29,32,33 ] 。 CCD作为一种实验 为了评估优化设计方法 影响HS-SPME每个参数的值(水平) 优化过程的响应。这种方法 图。 2,提取人体尿液挥发物的代表总离子色谱图,用的是50/30流明二乙烯基苯/ carboxen /聚二甲基硅氧烷 ( DVB / CAR / PDMS )固相微萃取(SPME )纤维,在三个不同的pH值:酸性( 1-2) ,生理( 5-6 )和碱性( 9-10) 。 图。固相微萃取(SPME )纤维3 。效率 在从收集的挥发性化合物的提取涂层 人体尿液样品采用顶空固相微萃取( HS-SPME ) 。结果 提出的总响应领域的一式三份的平均值 获得的气相色谱 - 离子阱/质谱法(GC -IT / MS)的色谱图和标准偏差。 6 M.蒙特罗等人。 /欧洲癌症杂志XXX的(2014 ) XXX-XXX 请引用本文按为:蒙泰罗M.等,挥发性人通过固相微萃取结合尿代谢组分析用气相色谱 - 质谱生物标志物的发现:在应用试点研究与肾细胞癌,欧元J癌症( 2014年) ,包含http://歧视患者 dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2014.04.011 使能,同时,个人的评价 每个变量的响应的意义,在这种情况 在HS- SPME尿挥发性代谢物,并且还 的相关性在他们之中。这样的应用 统计优化程序类型是有利 在单变量方法在可能的影响 是不是采取了重要的变量之间的相互作用 考虑。此外,这种类型的策略允许 的最佳条件与更少的决心 实验数[ 47 ] 。虽然CCD ,多元 分析,先前被用在其它基质, 即在食品饮料[48,49] ,据我们所知,这 是第一次,它被应用到尿液样本。在这种 试验中, 29次试验随机地执行与 响应值(总面积)列于表3中。 帕累托图(图4)是用来说明的贡献 每个因子的提取效率。这 图表包含一个酒吧为每个因素包括与 它们的组合,排序,从最显著到 的至少一个。在图表绘制一条垂直线 定义了学生t -检验的临界值。任何因素 或者是由条表示因素组合 延伸到临界值的右侧被认为是 为响应(提取效率)显著。 在我们的研究中,95%的显着性水平被认为是 因此,临界值设定为0.05 。正棒的 分数定义了因子和之间有直接的关系 输出响应,即认为增加值 那因素导致一个增强的响应。在 另一方面,负分限定的反比关系 之间的因子的水平和响应。 考虑到所得帕累托图,温度 提取[ ( 4 ) T( L) ]是最积极的, 对于挥发性轮廓的提取显著因子 从人的尿液样本由HS-SPME ,其次是 提取时间[(3 )纤度( L)] ,并加入盐[ (1)的NaCl (L)] 。当中的因素进行评估,孵化效果 时间[(2 )锡(L)]是不为实验显著 自治领成立(即培养时间 包含在优化的值)。此外,还有 是时间之间的正,虽然轻微,互动 和提取( 3Lby4L )的温度。理想情况下,该 培养和提取时间应使分区 化合物的达到平衡[ 50] 表3 为响应(总面积)的实验条件和值获得的用于中心复合设计( CCD ) 的提取条件,由人尿的顶空固相微萃取( HS-SPME )的优化。 实验号实验条件 氯化钠( G) TINC (分钟)文本(分钟)乙T( ℃) C响应(总aread ) 1 0.8 10 45 30 5.3238E +10 2 0.4 5 30 40 9.1059E +10 3 1.2 5 30 40 5.3263E +10 4 0.4 15 30 40 1.4738E +11 5 1.2 15 30 40 4.4111E +10 6 0.4 5 60 40 9.8210E +10 7 1.2 5 60 40 7.6369E +10 8 0.4 15 60 40 1.4902E +11 9 1.2 15 60 40 7.1890E +10 10 0.8 10 15 50 1.3624E +11 11 0.8 0 45 50 8.5103E +10 12 0.0 10 45 50 1.9914E +11 13 0.8 10 45 50 6.0851E +10 14 0.8 10 45 50 1.3204E +11 15 0.8 10 45 50 1.0604E +11 16 0.8 10 45 50 2.0893E +11 17 0.8 10 45 50 3.8581E +10 18 1.6 10 45 50 1.0386E +11 19 0.8 20 45 50 1.1963E +11 20 0.8 10 75 50 1.2023E +11 21 0.4 5 30 60 5.7463E +10 22 1.2 5 30 60 1.5521E +11 23 0.4 15 30 60 7.0845E +10 24 1.2 15 30 60 3.0427E +11 25 0.4 5 60 60 1.2855E +11 26 1.2 5 60 60 1.1115E +11 27 0.4 15 60 60 1.2827E +11 28 1.2 15 60 60 1.2239E +11 29 0.8 10 45 70 1.4940E +11 一个TINC - 培养时间。 乙文 - 提取时间。 C T - 提取和培养温度。 任意单位d总面积表示。 M.蒙特罗等人。 /欧洲癌症杂志XXX的(2014 ) XXX-XXX 7 请引用本文按为:蒙泰罗M.等,挥发性人通过固相微萃取结合尿代谢组分析用气相色谱 - 质谱生物标志物的发现:在应用试点研究与肾细胞癌,欧元J癌症( 2014年) ,包含http://歧视患者 dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2014.04.011 并且,在一般情况下,在搅拌和加热倾向于 减少所需要的时间,特别是对于低挥发性 化合物。与此相反,在吸附 由纤维化合物倾向于降低与更高 的温度,这限制了化合物的量 提取[ 16 ] 。此外,使用高的温度时, 不耐热的代谢产物降解的风险 需要考虑的一个重要的变量 在结果的解释。事实上,使用较高 温度,我们可以提高我们的富集 挥发性提取物具有低挥发性代谢产物,并在 同一时间,导致更不耐热的降解 的,从而导致他们的损失及外观 降解产物。的加成盐是频繁 用于挥发性物质的提取,由于提取 “盐析”作用,从而提高分析物的量 进入顶部空间,并随后进入纤维 涂料[ 50 ] 。图。图5A和B显示响应面 P = .05 标准化的效应估计值(绝对值) 1Lby2L 2Lby4L (2)锡(L) 1Lby3L 2Lby3L 锡(Q)的 1Lby4L 3Lby4L 特( Q)的 T( Q) 氯化钠(Q)的 (1)氯化钠( L)的 (3)纤度( L)的 (4)T ( L)的 15.82 7.82 6.14 -6.06 4.59 -2.84 2.81 1.69 -1.60 1.31 1.06 0.58 -0.17 -0.13 图。 4,帕累托图的24析因设计总色谱峰面积(锡标准化的作用 - 培养时间( 2 ) ,特克斯 - 萃取时间 (3);笔 - 萃取温度和( 4 )氯化钠( 1 ) ) 。 (L)和(Q)的平均线性和二次效应,分别。 y轴包括所有的变量 该研究(隔离)和它们的可能组合及其对学习效果的优化将其X轴记者描述 显着性值。 图。 5,响应面获得通过中心组合设计条件的优化: (一)提取温度( ? T, C)和 提取时间(文字, min)和提取(B)的温度(T , ℃)和NaCl的含量(g ) ,对于挥发性轮廓从尿中提取 样品顶空固相微萃取( HS-SPME ) 。响应是每组下得到的总色谱峰面积 条件。 8 M.蒙特罗等人。 /欧洲癌症杂志XXX的(2014 ) XXX-XXX 请引用本文按为:蒙泰罗M.等,挥发性人通过固相微萃取结合尿代谢组分析用气相色谱 - 质谱生物标志物的发现:在应用试点研究与肾细胞癌,欧元J癌症( 2014年) ,包含http://歧视患者 dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2014.04.011 在CCD获得的模型。根据计算结果, 整体最优值和萃取条件, 所研究的范围内,则有:培养时间 9分钟, 24分钟提取一次,0.59克盐加 和提取在68 ? C。 3.2 。挥发性配置文件作为判别工具 证明该挥发性轮廓可以是概念 在尿液从RCC患者的歧视使用 和健康对照组,无监督统计方法 (PCA )是适用。所得到的结果示于 图。 6,尽管在高的个体差异 泌尿访问,特别是在控制 组,而事实上,这组变量只能 解释的变异的60.33 %的第2间 主成分( PC1和PC2 ) ,这些探索 结果仍然看好。 4,结束语 可能使用的挥发性尿轮廓来 鉴别病理条件下有报道, 至少,自1971年[ 51 ] 。这些作品极大地凸显 尿液的挥发性仿形因为它避免了潜在的 一些与GC / MS分析尿液分析相关的挑战 [38] 。然而,考虑到HSSPME的高灵敏度 到可能影响实验条件 的分布和吸收/吸附率 化合物中,关键的是要优化和控制那些 在提取过程中的实验变量。 在这里,我们描述了开发和优化 的HS-SPME方法对尿分析 人体代谢。本研究的主要优点 是使用一种实验设计,使之 研究多个变量同时作用。 在加上一个中央特别设计的阶乘 复合设计( CCD)的一些优化 参数是已知的干扰的提取 效率,因为CCD能使之间可能的相互作用研究 他们之间。结果表明, pH值, 光纤涂料和提取温度的强烈影响 总色谱峰面积。最佳 提取条件为挥发人类的分析 尿代谢被认为是:酸性pH值(2) , DVB / PDMS纤维涂层,另外0.59克氯化钠, 培养和提取在68 ?的C期间9分钟 24分钟。 在开发和优化HS-SPME法是 在患病之间( RCC)的歧视待遇 和正常的尿液样本,显示希望的结果 这将在不久的将来进行探讨,以提高其 适用性。
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